Das auf einer runden Holztafel gemalte Gemälde wurde um 1506 oder um 1506 fertiggestellt und ist das einzige erhaltene Tafelbild, das Michelangelo als reifer Künstler angefertigt hat. Die Heilige Familie mit St. John soll von Agnolo Doni, einem erfolgreichen Florentiner Kaufmann, in Auftrag gegeben worden sein, und das Werk wird manchmal "The Doni Tondo" genannt. Es wird vermutet, dass das Gemälde ein Geschenk für seine Frau Maddalena Strozzi, die Tochter einer prominenten toskanischen Familie, sein sollte, möglicherweise anlässlich ihrer Hochzeit oder vielleicht der Geburt ihrer ersten Tochter. Die runde oder tondoförmige Form des Gemäldes zusammen mit dem häuslichen Charakter seines Themas zeigt, dass es sich um ein Stück handelt, das in einem Haus ausgestellt werden sollte, und es gibt Hinweise darauf, dass dieses Werk mindestens bis 1591 im Haus der Doni blieb. Das Gemälde bleibt in seinem Originalrahmen und es ist möglich, dass Michelangelo, obwohl angenommen wird, dass es von Marco und Francesco Del Tasso geschnitzt wurde, zu seiner Gestaltung beigetragen hat. Das Design umfasst eine Reihe von Motiven, darunter Monde und Löwenköpfe, die, den Wappen der Familien Doni und Strozzi entnommen, die Vereinigung der beiden Familien symbolisieren, die ihre Ehe darstellte. Agnolo Doni und seine Frau waren kultivierte Kunstsammler und beauftragten die führenden Künstler ihrer Zeit mit Werken, darunter Porträts von jedem von ihnen bei Raffael. Es ist auch bekannt, dass sie im Besitz von Werken von Donatello und Fra Bartolommeo waren. Michelangelo war aus Rom nach Florenz zurückgekehrt, da sich das Projekt zum Bau des Grabes von Papst Julius II. aus Geldmangel verzögert hatte. Es ist wahrscheinlich, dass er dieses Stück fertigstellte, bevor er nach Rom zurückkehrte und 1508 mit der Arbeit an der Sixtinischen Kapelle begann. Das Gemälde zeigt die auf dem Boden sitzende Jungfrau Maria, die sich umdreht, um das Jesuskind von Joseph zu empfangen, das sich hinter sie hockt. Michelangelo schildert perfekt die liebevolle Fürsorge der beiden Eltern in diesem kleinen Akt, das Kind zwischen ihnen zu übergeben, sowohl im sorgfältigen Umgang in ihrer komplexen Pose als auch in der Liebe und Konzentration, die sich in ihren Gesichtern zeigt. Dahinter ist ein junger Hl. Johannes der Täufer in einem Wasserbecken abgebildet, das symbolisch für seine kommende Taufrolle steht. Im Hintergrund sitzt eine Gruppe nackter Jugendlicher, die einem Fries aus klassischen Figuren ähnlich sieht. Es gab viele Interpretationen dieses Werkes von Michelangelo. Es kann einfach als Abbild einer liebevollen Familie gesehen werden und war zweifellos ein wichtiger Aspekt des Gemäldes für Agnolo Doni und seine junge Frau. Die nackten Figuren dahinter werden von einigen als von den klassischen Figuren von Laokoon und seinen Söhnen beeinflusst, die 1506 in Rom ausgegraben wurden. Diese Figuren könnten die heidnische Welt repräsentieren. Zwischen diesen heidnischen Jünglingen und dem Heil der Christenheit steht nur das Sakrament der Taufe, dargestellt durch die Figur des jungen Johannes des Täufers, die zwischen ihnen und der Heiligen Familie gezeigt wird.